Усекающие мутации гена ALPK3 являются важной генетической причиной гипертрофической кардиомиопатии, составляя около 2% случаев. В настоящее время для таких пациентов отсутствуют радикальные методы лечения. В недавней работе, опубликованной в журнале «Nature Cardiovascular Research», была предпринята попытка доставки полноразмерного гена ALPK3 с помощью вектора AAV; в животных моделях и человеческих сердечных органоидах наблюдалось значительное восстановление функции.
Особенность этого исследования заключается в том, что геном используемого для терапии вектора достигал 5,8 kb, что превышает обычный предел упаковки AAV, составляющий около 4,7 kb. Как «перегруженный» вектор AAV обеспечивает эффективную и безопасную доставку генов in vivo? Ответ связан с множеством инженерных соображений: выбором промотора, оптимизацией элементов экспрессии и тканеспецифичной регуляцией.
Логика дизайна сверхъемкого вектора
Исследователи сначала сравнили эффективность экспрессии ALPK3 под управлением двух промоторов. Результаты показали, что уровень экспрессии человеческого ALPK3 под управлением кардиоспецифичного промотора TNNT2 примерно в 5 раз превышал таковой под управлением широко экспрессирующегося промотора CMV.
Это различие обусловлено не только самим промотором. Дизайн вектора также включал ряд оптимизаций: замена последовательности polyA бычьего гормона роста на синтетический сигнал polyA длиной 53 bp, удаление нерегуляторных спейсерных последовательностей. Эти изменения позволили сократить геном вектора на 300 нуклеотидов.
Геном размером 5,8 kb по-прежнему превышает традиционный предел упаковки. Однако анализ методом qPCR показал отсутствие значимых различий в числе копий на обоих концах векторной ДНК, а на уровне РНК также не выявлено заметных различий между 5′- и 3′-концами. Это указывает на то, что данный сверхъемкий вектор способен доставлять in vivo полную полноразмерную последовательность, а не только ее часть.
Правильность трансляции и локализации белка ALPK3 также была подтверждена. Белок ALPK3, меченный Flag-тагом, точно достигает M-линии саркомера и колокализуется с ACTN2 и OBSCN. Правильное сворачивание и локализация полноразмерного белка являются предпосылкой реализации функции.
Профилактика в неонатальном периоде и обращение вспять во взрослом возрасте
Исследователи провели две серии экспериментов с использованием мышиной модели, несущей пациент-производную мутацию Alpk3W1538X.
После однократной внутрибрюшинной инъекции 2,5×10¹¹ вирусных геномов в неонатальном периоде (P0) к 12-недельному возрасту масса сердца у мышей леченой группы снизилась на 63% по сравнению с контрольной группой. Эхокардиография показала, что различные параметры сердечной функции у мышей леченой группы восстановились до уровня, близкого к таковому у дикого типа, включая фракцию укорочения, ударный объем, толщину стенки и диастолическую функцию.
Еще большего внимания заслуживает эксперимент по лечению во взрослом возрасте. У 6-недельных мышей с мутацией Alpk3 уже проявлялся отчетливый фенотип кардиомиопатии: увеличение сердца, нарушение систолической и диастолической функции. После однократной инъекции вектора в хвостовую вену в дозе 1×10¹⁴ vg/kg сердечная функция в леченой группе восстановилась до уровня дикого типа в течение 4 недель и поддерживалась до конечной точки эксперимента на 18-й неделе.
Гистологический анализ подтвердил обращение патологии вспять. Площадь поперечного сечения кардиомиоцитов у мышей леченой группы нормализовалась, структура саркомеров приобрела упорядоченное расположение. Исследователи отмечают, что, поскольку у данной модели гипертрофия миокарда присутствует уже при рождении, наблюдаемое улучшение представляет собой истинное обращение патологии вспять, а не просто остановку прогрессирования заболевания.
Примечательно, что у мышей дикого типа, получавших такое же лечение, значимых изменений сердечной функции не наблюдалось, что указывает на отсутствие негативного влияния гиперэкспрессии ALPK3 как таковой.
Восстановление протеостаза
Известно, что ALPK3 организует в M-линии саркомера центр контроля качества белков, регулируя оборот сократительных белков. Для изучения механизма терапии исследователи провели количественный протеомный и фосфопротеомный анализ сердечной ткани.
У мутантных мышей из примерно 6 000检测 белков 1 612 имели аномальную экспрессию. Повышенные белки в основном были связаны с A-полосой, убиквитинированием, белками теплового шока и протеолизом, тогда как пониженные белки были связаны с митохондриями, трансляцией и метаболизмом аминокислот. После генной терапии ALPK3 аномальная экспрессия сохранилась лишь у 81 белка — то есть 95% молекулярных признаков заболевания были обращены вспять. Степень обращения фосфопротеома была еще выше и достигла 98%.
Дисбаланс между толстыми и тонкими филаментными белками также был скорректирован. В мутантном сердце все белки толстых миофиламентов накапливались, а белки тонких миофиламентов снижались. Считается, что этот дисбаланс непосредственно приводит к нарушению сократительной функции. После лечения оба показателя восстановились до уровня дикого типа.
Кроме того, активность протеасом в мутантном сердце была значительно подавлена, а после лечения восстановилась. E3-лигазы TRIM54, TRIM55 и TRIM63, локализующиеся в саркомере, специфически повышались после лечения. Эти молекулярные изменения в совокупности указывают на один вывод: генная терапия ALPK3 восстанавливает сердечную функцию путем восстановления протеостаза.
Потенциал расширения показаний
ALPK3 и титин (titin) совместно используют в M-линии сеть контроля качества белков. Усекающие варианты TTN являются наиболее частой генетической причиной дилатационной кардиомиопатии, составляя до 25%. Поскольку ген TTN превышает 100 000 нуклеотидов, что значительно превосходит упаковочную способность AAV, традиционные стратегии генного замещения трудно применимы.
Исследователи предположили, что доставка ALPK3 может обойти сам ген TTN и улучшить функцию путем восстановления общего пути протеостаза. Для проверки этой гипотезы они использовали кардиальные органоиды, полученные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток, несущих усекающий вариант TTN.
Данные секвенирования РНК единичных ядер показали, что усекающий вариант TTN снижает экспрессию ALPK3 дозозависимым по гену образом. В функциональных экспериментах сократительная сила органоидов TTNtv/+ была значительно ниже, чем у изогенных контролей. После обработки AAV6-ALPK3 сократительная сила восстановилась до уровня дикого типа, не сопровождаясь аномалиями других физиологических параметров.
Протеомный анализ показал, что различающиеся белки между леченой и контрольной группами сосредоточены в таких путях, как протеолиз, протеасома и регуляция цитоскелета. После перекрестного сравнения с данными на мышах было идентифицировано 55 общих белков, функции которых в основном связаны с протеостазом, цитоскелетом и регуляцией метаболизма.
Выбор между полноразмерным и минимизированным вариантами
Один из вопросов, заслуживающих обсуждения: поскольку полноразмерный вектор ALPK3 превышает обычную упаковочную емкость, следует ли выбирать стратегию минимизации? В недавних исследованиях сообщалось о конструкции miniALPK3, которая обеспечила частичное восстановление функции у новорожденных мышей, однако эффект уступал почти полному восстановлению, достигнутому с полноразмерным белком в настоящем исследовании.
Минимизированный белок также может создавать новые эпитопы в месте соединения, вызывая иммунный ответ. Это уже было описано в генной терапии микродистрофина. Исследователи считают, что, хотя сокращение генома вектора является важным соображением, имеющиеся данные поддерживают использование полноразмерного ALPK3.
Это исследование предоставляет очередное доказательство осуществимости сверхъемких векторов AAV. Каковы различия в упаковке, очистке и контроле качества сверхъемких векторов по сравнению с обычными векторами? Влияние размера генома на стабильность вирусных частиц, эффективность трансдукции и долгосрочную экспрессию в настоящее время все еще недостаточно системно изучено. По мере расширения генной терапии на более крупные гены эти вопросы будут все больше становиться центральной темой разработки технологических процессов.
