Болезнь Sandhoff (SD) вызывается дефектом генов HEXA/HEXB, что приводит к дефициту фермента Hex и накоплению GM2 ганглиозида в лизосомах. В предыдущих исследованиях для доставки AAV чаще использовались интрацеребральный путь или путь через спинномозговую жидкость, однако они высокоинвазивны. В данном исследовании был использован внутривенный бицистронный вектор AAV9 для лечения модели кошки с SD на предсимптомной стадии (около 1 месяца жизни). Ключевое противоречие заключается в том, что внутривенная доставка требует преодоления гематоэнцефалического барьера, а эффективность коэкспрессии двух субъединиц трудно гарантировать.
Бицистронная конструкция: необходимость единого вектора
В исследовании использовался единый вектор AAV9, в центре которого находится энхансер CMV, а по бокам — обратно ориентированные промоторы куриного β-актина, которые по отдельности управляют кДНК α- и β-субъединиц Hex. Технологическая логика этой конструкции ясна: если использовать два независимых вектора, то после внутривенной инъекции разведение кровотоком делает вероятность котрансдукции одной и той же клетки двумя векторами крайне низкой. При этом только HexA (αβ) является единственной активной формой, расщепляющей GM2, и обе субъединицы должны экспрессироваться в одной клетке.
Низкая доза (5×10¹³ vg/kg) увеличила выживаемость с 4,3 месяца до 8,3 месяца, высокая доза (2×10¹⁴ vg/kg) — до 12,4 месяца. В группе высокой дозы генерализованный тремор не наблюдался, тогда как в группе низкой дозы у 3 из 4 животных он появился с задержкой до 6,8 месяца.
Технологическое противоречие между распределением в тканях и эффективностью экспрессии
Данные о распределении вектора показывают, что наибольшая концентрация наблюдается в коре головного мозга (0,050–9,658 vg/диплоидный геном), тогда как в мозжечке, стволе мозга и спинном мозге она ниже. Однако наибольшее число копий вектора обнаружено в печени, при этом активность HexA никогда не превышала 0,09 от нормы. После расчёта отношения «удельная активность/геном вектора» оказалось, что в мозге, спинном мозге, скелетных мышцах и сердце это отношение в 23,0–139,8 раза выше, чем в печени.
Это различие указывает на ключевую проблему технологического уровня: обилие генома вектора не равно выходу функционального белка. Авторы отмечают, что данному вектору не хватает элемента WPRE, тогда как WPRE в печени может повышать экспрессию до 5,8 раза. Кроме того, печень кошки, возможно, сама по себе неблагоприятна для экспрессии некоторых конструкций AAV. Для технологической разработки выбор тканеспецифичных промоторов или усиливающих экспрессию элементов напрямую влияет на терапевтический выход на единицу вектора.
Краткосрочная коррекция и долгосрочное угасание
На 16-й неделе в группе высокой дозы окрашивание GFAP, морфология Iba1 и число Olig2-положительных клеток приближались к норме. Однако при долгосрочном наблюдении (до гуманной конечной точки) морфология астроцитов и микроглии вновь приблизилась к таковой в нелеченой группе — воспаление было обращено вспять лишь временно.
Одновременно число копий вектора от краткосрочной к долгосрочной группе снизилось почти во всех отделах ЦНС, что может быть связано с потерей трансдуцированных делящихся клеток или с иммунным ответом. У всех леченых кошек возникли титры антител к AAV9 (1:1000–1:256 000), что означает, что повторное введение может быть неэффективным или даже опасным.
Значение для технологии получения и очистки AAV
Дозозависимый эффект в этом исследовании выражен чётко, однако в группе высокой дозы все показатели всё ещё не полностью нормализовались. С технологической точки зрения заслуживают внимания несколько вопросов: во-первых, высокий захват печенью при низкой экспрессии указывает на то, что распределение вектора в нецелевых тканях может отнимать часть эффективной дозы; во-вторых, долгосрочное угасание экспрессии и потеря генома вектора затрагивают баланс между чистотой вектора, долей пустых капсидов и эффективностью трансдукции; в-третьих, образование антител ограничивает повторное введение, требуя максимально высокого качества вектора при однократном введении.
В процессе очистки то, насколько удаётся снизить долю пустых капсидов и повысить эффективность упаковки полного генома, напрямую связано с функциональным выходом на единицу vg. А явление разобщения распределения в тканях и эффективности экспрессии также указывает на то, что при оценке технологии нельзя ограничиваться лишь числом копий вектора — необходимо учитывать активность функционального белка.
Открытый вопрос: когда внутривенно доставленный вектор в больших количествах накапливается в печени, но не экспрессируется, следует ли на технологическом уровне в первую очередь оптимизировать тканевую таргетность или повышать эффективность трансдукции отдельных клеток?
